乳、乳制品及饲料中三聚氰胺的测定
一．名词简介
1. 三聚氰胺理化性质
三聚氰胺：英文名“melamine”，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。分子式：C3N6H6、C3N3(NH2)3；分子量：126.12；物理性能：白色结晶粉末，无毒，无味；相对密度：1570kg/m³；熔点：在常压下，354℃分解；升华温度：300℃；溶解性：能溶于甲醇、甲醛、乙酸、热乙二醇、甘油、吡啶；微溶于水、乙醇；不溶于乙醚、苯和四氯化碳，水溶液呈弱碱性。
化学性能：三聚氰胺是一种重要的氮杂环有机化工原料，显弱碱性，能够与各种酸反应生成三聚氰胺盐；在强酸或强碱液中，三聚氰胺发生水解，胺基逐步被羟基取代，生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸；三聚氰胺与醛类反应生成加成化合物；三聚氰胺与甲醛反应制成树脂，三聚氰胺树脂是一种多种用途的材料，防火耐热且有很高的稳定性，用于生产塑料、地板砖，厨房用具，防火纤维，商业滤膜，胶水和阻燃剂。
2. 乳制品
是指以生鲜牛（羊）乳及其制品为主要原料，经加工而制成的各种食品。本标准所指的乳制品包括液体乳类（杀菌乳、灭菌乳、酸牛乳、配方乳）、乳粉类（全脂乳粉、脱脂乳粉、全脂加糖乳粉和调味乳粉、婴幼儿乳粉、其他配方乳粉）、含乳饮料类、炼乳类（全脂无糖炼乳、全脂加糖炼乳、调味炼乳；配方炼乳）、乳脂肪类（稀奶油、奶油、无水奶油）、干酪类（原干酪；再制干酪）、乳冰淇淋类（乳冰淇淋、乳冰）和其他乳制品类（干酪素、乳糖、乳清粉、浓缩乳清蛋白）等。
1. 原理
试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤得到测试液，经液相色谱测定，根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。
2 试剂
方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为
GB/T 6682-2008中一级用水，溶液为水溶液。
2.1
磺基水杨酸。
2.2
柠檬酸。
2.3
辛烷磺酸钠：液相色谱离子对试剂。
2.4
乙腈：色谱纯。
2.5
盐酸。
2.6
60 g/L
磺基水杨酸：称取
60 g
磺基水杨酸用水定容至
1 L
。
2.7
0.1 mol/L
盐酸：量取
8.3 mL
盐酸用水稀释至
1 L
。
2.8
缓冲液：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为
10 mmol/L
。
2.9
三聚氰胺标准品：已知含量大于
99%
。
2.10
标准储备液：称取三聚氰胺标准品
0.01g
（准确至
0.0 001g
），用甲醇配制成浓度为
1mg/mL
标准储备液。
2.11
标准系列：将标准储备液用
0.1 mol/L
盐酸逐级稀释至
0.25µg/mL
，
0.50µg/mL
，
1.00 µg/mL
，
2.00 µg/mL
，
4.00 µg/mL
，
5.00 µg/mL
，
10.0 µg/mL
的系列标准溶液。
3 仪器成套性
3.1
液相色谱仪
3.1.1 P3000
型
高压输液泵
3.1.2 UV3000
紫外检测器
3.1.3 Rehodyne
手动进样阀(20
μl)
3.1.4 CXTH3000
色谱工作软件
3.1.5 ODS
（VenusilASB-C18
色谱柱）
250 mm
×4.6 mm
，5µm
3.1.6
分析启动工具包
3.1.7
溶剂托盘
3.1.8
试剂包
3.1.9
保护柱和柱芯
3.1.10
真空固相萃取装置（含混合型的阳离子交换柱10
根）
3.2 溶剂过滤器（含真空泵）
3.3 超声波清洗器
3.4 柱温箱
3.5 高速离心机：转速
>4 000
r/min
3.6 旋涡混匀器
3.7 分析天平：感量0.1mg
4 样品处理
4.1 固态乳制品
称取
1.0 g
左右试样（准确至
0.0 001 g
），加入
0.1 mol/L
盐酸约
15 mL
，涡旋混匀，超声提取
30 min
后加入
60 g/L
磺基水杨酸
6 mL ~
8 mL
，用
0.1 mol/L
盐酸定容至
25 mL
，混匀后离心，上清液经
0.45 µm
的微孔滤膜过滤后进样。
4.2 液态乳制品（包含酸奶）
称取
15 g
左右试样（准确至
0.0 001 g
），加入
60 g/L
磺基水杨酸
3 mL~
4 mL
，用
0.1 mol/L
盐酸定容至
25 mL
，混匀后离心，上清液经
0.45 µm
的微孔滤膜过滤后进样。
4.3 饲料
称取1.0g
左右试样（准确至
0.0 001 g
），将样品用研钵充分碾碎混匀，加入
0.1 mol/L
盐酸约
15 mL
，涡旋混匀，超声提取
30 min
后加入
60 g/L
磺基水杨酸
6 mL ~
8 mL
，用
0.1 mol/L
盐酸定容至
25 mL
，混匀后离心，上清液经
0.45 µm
的微孔滤膜过滤后进样。
5 测定步骤
5.1 色谱条件
5.1.1
色谱柱：ODS
或C
8
，
250 mm
×4.6 mm
，5µm
。
5.1.2
流动相：缓冲液︰乙腈=
85
︰
15
。
5.1.3
流速：
1.0 mL/min
。
5.1.4
柱温：
40
℃。
5.1.5
波长：
240 nm
。
上述色谱条件是典型的，可根据实际情况做具体调整。如果分离效果不理想，将水相改为：柠檬酸和辛烷磺酸钠浓度均为
10 mmol/L
，加3mL
三氯乙酸，配制成1000mL
溶液，流动相用氨水调PH
值3.9
到3.95
。
5.2测定
5.2.1 标准曲线制备
将标准系列
0.25µg/mL
，
0.50µg/mL
，
1.00 µg/mL
，
2.00 µg/mL
，
4.00 µg/mL
，
5.00 µg/mL
，
10.0 µg/mL
分别进样
20 µL,
以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作图，制作标准曲线。
5.2.2 样品测定
取制备好的试样溶液进样20 µL,进行液相色谱分析。
根据保留时间和紫外吸收光谱定性，根据峰面积进行定量。三聚氰胺的标准样品色谱图见图1
，液态奶样品色谱图见图2
，奶粉样品色谱图见图3
。
图1 标样色谱图
仪器：188bet金宝搏官网首页 LC3000
色谱柱：188bet金宝搏官网首页 ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸调PH3.9
流速
：1.0 mL/min
柱温：40 ℃
波长：240 nm
图2 液态奶样品色谱图
仪器：188bet金宝搏官网首页 LC3000
色谱柱：188bet金宝搏官网首页 ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸调PH3.9
流速
：1.0 mL/min
柱温：40 ℃
波长：240 nm
图3 奶粉样品色谱图
仪器：188bet金宝搏官网首页 LC3000
色谱柱：188bet金宝搏官网首页 ODS柱 250 mm×4.6 mm，5μm
流动相：缓冲液︰乙腈=85︰15，用三氯乙酸调PH3.9
流速
：1.0 mL/min
柱温：40 ℃
波长：240 nm
6 结果计算
6.1 计算
试样中三聚氰胺的含量（
mg/kg）按式（1）计算:
C
×V
X =
————………………………………………………
（1
）
m
式中：X
—样品中三聚氰胺含量，mg/kg
；
C
—从标准曲线上查出的含量，µg/mL
；
V
—定容体积，mL
；
m
—称样量，g
。
平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。
本文参考以下方法：
HPLC-UV检测方法
三聚氰胺在传统的C18柱上保留很差，需要用离子对试剂色谱方法才能有良好的保留与分离，按照美国食品药品监督管理局（FDA）的三聚氰胺检测方法和中国农业部颁部的三聚氰胺检测方法，采用北京创新通恒科技有限公司的ODS，Ｃ１８色谱柱，能够得到良好的结果。
1、 三聚氰胺的FDA检测方法
色谱柱：188bet金宝搏官网首页ODS 4.6×250mm
缓冲液：10mM柠檬酸，10mM辛烷磺酸钠，调pH为3.0。
流动相：缓冲液：乙腈=85：15
进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10μL，
进样前用0.22μm针式过滤器过滤
流 速：1.0mL/min
柱 温：40 ℃
波 长：240nm
2、三聚氰胺的中国农业部颁标准检测方法
色谱柱：188bet金宝搏官网首页ODS 4.6×250mm
缓冲液：10mM柠檬酸, 10mM庚烷磺酸钠
流动相：缓冲溶液:乙腈=85:15
进样量：样品用缓冲液溶解成约0.1mg/mL，进10uL
进样前用0.22μm针式过滤器过滤
流 速：1.0mL/min
柱 温：40℃
波 长：240nm
188bet金宝搏官网首页 技术部
